讓ImageJ在Western Blot圖像分析中綻放-4

  《 如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》一文探討用ImageJ軟件的Plot Profile分析功能創(chuàng)建ROI的具體操作方法。接下來，要把Western Blot條帶圖像ROI轉(zhuǎn)化成精準數(shù)據(jù)，要邁過難關就是如何有效實施ROI的背景扣除。
      本文聚焦ImageJ圖像分析中Subtract Background所用的神器滾球Rolling ball，理解其校正圖像背景的原理基礎上，探討在Western Blot條帶定量分析中的如何有效運用這一神器的問題。
一、ImageJ中的rolling ball到底如何扣除背景？
      Rolling Ball,即Rolling disc，Rolling ball algorithm，Rolling ball background subtraction algorithm, rolling ball procedure,稱為滾球算法，滾球背景扣除算法, 由Sternberg Stanley在《Biomedical image processing》（IEEE Computer, Jan 1983)中首先提出，至今仍是醫(yī)學圖像處理中校正圖像背景或去除背景強度差異（remove background intensity variations）的著名程序工具。
      據(jù)網(wǎng)上公開的斯坦利·斯特恩伯格《Biomedical image processing》原文部分內(nèi)容，Rolling ball algorithm理論模型如圖1所示。

      把數(shù)字圖像比作一幅3D地形圖，則地形中的任一點，相當于一個像素，除具備X、Y經(jīng)緯坐標，同時還有一定的海拔高度（相當于圖像中像素強度）。 滾球算法理論，就是設想有一個圓球沿著3D圖像的“地表”下地形起伏而滾動（rolled over the bottom side of this surface）。功效如同地鐵修建用盾構機，滾球在滾動中，把表面可觸及到地質(zhì)成份通通鑿去（the hull of the volume reachable by the ball is the background to be subtracted）。

      地形中某些像素聚集形成一定海拔高度的信號峰突出地表，而球體因直徑限制而卡嵌在“峰”的兩翼后，球體只接觸到峰的底部一定高度范圍。

       無論是峰內(nèi)還是峰外，凡球體之所及，通通削除。去除背景后的3D地表形態(tài)，狀如圖2中的喀什特地貌圖：一望無垠的平野，點綴著一座座千姿百態(tài)的孤峰。

       將整個三維地表來個扭轉(zhuǎn)乾坤后，依然是一個高低起伏的3D地貌。

       倒立的山峰，此時形同大小深淺不同的坑。圓球直徑過小的話，會直接掉入坑中。當圓球半徑足夠大，因坑口支撐，球體僅有部分陷于坑中。 球越大則陷得越淺。

       峰口處箭頭所指為球-峰切點。切點間的圓弧線被視為是坑周圍地形自然延伸（相當于圖像的背景），不視為坑的有效容積，需予剔除。切點弧線以下橙色區(qū)域，才算作坑的有效容積（相當于圖像信號峰的有效強度值）。

       圓球陷入坑口部分的深度，取決于兩個關聯(lián)因素：

1）坑的跨度

       跨度越大，要求球體直徑相應也大，否則大半球體深陷甚至沉沒于峰體中，造成峰切削過度；跨度小，則與之有效相切匹配的球體相應也小。

2）球體直徑

       不同峰型，底部外形不一，跨度不同，與之匹配的圓球直徑也不同。

       與Photoshop對圖像調(diào)整僅局限于選區(qū)不同，滾球背景扣除算法中，圓球用逐行滾動方法掃描圖像中每一個像素點。但凡暴露于”坑“外較平整處的像素，皆為球可觸及之所，該像素信號值予以清除。滾球無法觸及的像素，削去球體可達到部分信號后再被分析統(tǒng)計。由于每個選區(qū)通常包括數(shù)十行像素，軟件會將相同Y坐標像素的像素按列為單位，將“殘余”像素強度值平均后予以呈現(xiàn)和統(tǒng)計。

       滾球半徑不同，滾球處理后，整幅圖像所得的像素強度也不同。對不不同的“坑”（信號峰），采用不同的滾球半徑處理，背景扣除后的統(tǒng)計值存在區(qū)別。

       實測也表明，同一個圖像副本，相同ROI設置，采用軟件默認的50像素滾球半徑設置，最后的分析值與實測中優(yōu)化的半徑值差距可謂天然之別。以《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測-上》中所用的條帶1、5為例，采用實測優(yōu)化滾球半徑的分析值分別為17799、3557，而采用50個像素滾球半徑的分析值為20991、6502。經(jīng)兩種半徑處理后，條帶1和5的比值0.200 VS 0.310。分析結(jié)果徹底偏離了實驗中條帶蛋白原始含量的對比關系。

      不同條帶，由于條帶強度信號分布的差異，導致峰型各異，與之匹配的背景扣除滾球半徑值，必然有所區(qū)別。這正是前文《實測》所提及的一（條）帶一（背）景的的理論依據(jù)。

二、對ImageJ指南中rolling ball半徑設定方法描述的解讀
      關于圖像背景扣除用滾球半徑設定，ImageJ指南做了如下說明：
      【As a rule of thumb, for 8–bit or RGB images it should be at least as large as the radius of the largest object in the image that is not part of the background. Larger values will also work unless the background of the image is too uneven. 】
      根據(jù)經(jīng)驗，對于8位或RGB圖像，滾球半徑應該不低于圖像中最大分析目標的外形半徑。在圖像背景較均勻的情況下，設定半徑大于分析目標尺寸半徑亦可。但如果圖像背景太不均勻，半徑大并不好。
      【For 16-bit and 32-bit images with pixel value ranges different from 0～255, the radius should be inversely proportional to the pixel value range (e.g., for 16-bit images，pixel values 0～65535, typical values of the radius are around 0.2 to 5).】
      對于16位和32位圖像，圓球半徑應與像素值范圍成反比。例如 16位圖像，像素灰度值范圍為0～65535，圓球半徑通常為0.2～5像素）。
      ImageJ指南中，采用8-bit黑白灰圖像做示例很普遍，但卻沒有如16位和32位圖像那樣，提供8-bit圖像圓球半徑的參考“經(jīng)驗值”。但卻很容易讓人誤以為8位圖像應該也有一個跟像素值成比例的半徑值。剛好，這段描述文字下引用了一幅圖用于演示圖像背景扣除前后背景變化的效果（見圖4）。 

       圖中的subtraction background設置面板窗口中，有個50.0 pixels的Rolling ball radius。
      作為指南，原本應該對圖片的處、50像素半徑值的設置理由有個簡單的標注，卻只字未提。
      如果不加分析的話，可能部分人也會認為：8位圖像的滾球半徑可能也與像素值成比例，該半徑值可能也類似于0.2～5像素那樣是一個很小范圍。而正是這樣一種預期心理，加上50像素大于16位圖像的5個像素。于是，這個來路不明的50像素半徑值，就這樣稀里糊涂地成為了ImageJ愛好者眼中的網(wǎng)紅。在某乎發(fā)表的教程中，就采用了這個備受矚目的50像素作為Western Blot條帶定量分析中扣除背景滾球的半徑值。
      目前，基于我們自身的大量實測經(jīng)驗，可以認為，Western Blot條帶定量分析中，不結(jié)合圖像具體情況，動輒采用網(wǎng)紅半徑值的，大半都是錯誤的。
      對ImageJ軟件指南中這段話寥寥數(shù)十個單詞應該這樣來解讀是合理的：
      1）不同的8-bit圖像，如圖像背景平滑而連續(xù)（譬如電泳凝膠圖像等），則滾球半徑大于等于被分析對象的半徑。這個radius，可以理解為這個分析對象的幾何尺寸、半徑等，不能簡單理解為這圓型的分析對象。
      2）正如《如何用ImageJ為Western Blot條帶定量建立分析選區(qū)》建議的那樣，分析選區(qū)劃定的重要原則就要是盡最大可能把被分析對象所屬全部像素收入ROI，同時盡可能地把屬于圖像背景的像素從分析選區(qū)中排除出去。了解這一規(guī)則后，“the largest object in the image that is not part of the background”可理解為，在不包含圖像背景的前提下被分析對象所能覆蓋的最大范圍。
      3）被分析對象類型不同，則其所能覆蓋的范圍、自身規(guī)格尺度會有差別，而對應的滾球半徑也應存在區(qū)別。不同實驗類型，如熒光標記的細胞樣品，核酸蛋白的凝膠電泳，Western Blot實驗、菌體克隆計數(shù)，免疫組化病理切片等，獲取的實驗圖像區(qū)別很大。被分析對象，如菌體、WB條帶、發(fā)射熒光的細胞，染色的組織團塊等，在圖像上形成的斑點、區(qū)域的形態(tài)和圖像分布范圍各異，使得圖像處理用相應滾球半徑必有差異。換句話說，實驗者應根據(jù)不同樣品、分析對象圖像特殊性來決定圖像背景扣除用的最佳滾球半徑，而非一個50像素應用于所有類型圖像分析。
      4）同一個對象置，背景如果保持均勻，半徑略加大還可以。但若背景很不均衡、不連續(xù)，則增大滾球半徑，是無效的。
就是說，即便分析對象一致，如圖像所處的背景條件不一致，則對應的滾球半徑很可能不同。這暗示，滾球半徑值除了受分析對象尺寸范圍大小的限制，還受分析區(qū)域所處圖像背景情況制約。圖像背景不均衡不均勻的情況下，滾球半徑設定尺度會有變化。

三、Rolling ball合理設置對改進Western Blot條帶定量分析數(shù)據(jù)質(zhì)量具有重要意義
      ImageJ軟件圖像背景扣除的采用的算法，一個是經(jīng)典Rolling Ball另一個就是平滑拋物線算法（Sliding Paraboloid Algorithm）。但拋物線頂點曲率半徑還沿用的是滾球的半徑（a paraboloid that has the same curvature at the apex as a ball of that radius）。因此，無論經(jīng)典Rolling Ball還是更精細sliding paraboloid算法進行背景的扣除，滾球半徑值才是核心和關鍵。
      ImageJ軟件自投入應用數(shù)十年來，被分析過的圖像和類型多得難以計數(shù)。然而，官方在歷次用戶指南更新中，不同類型圖像所適用的滾球半徑值參考方案，從未發(fā)布。退一步說，授人以魚不如授人以漁。那怕總結(jié)出一套天下英豪應用過程中對不同實驗圖像的滾球半徑設定范例，也足以讓初學者受益匪淺?？上?，這個事情，即便是NIH，也難以滿足蕓蕓眾生的熱切期待。
      在Western Blot實驗圖像分析中，扣除ROI背景的滾球半徑的設置，到底參考什么radius或size，無論是ImageJ、UVP和Bio-Rad的軟件指南中，均無明確可供參考意見。
      事實上，背景扣除滾球半徑值的設置，對Western Blot圖像分條帶定量分析結(jié)果的影響巨大。滾球半徑設定不當，輕則有損實驗數(shù)據(jù)的準確性與可靠性，重則使實驗結(jié)果評估引入歧途。
      半徑越小，獲得的有效信號中的背景“水份”越小。不合理地縮小滾球半徑后，強信號條帶檢測值損失極為明顯。UVP在軟件操作指南也提到，過小滾球半徑會因“滾進”條帶內(nèi)部而大量消除有效信號數(shù)據(jù)（An excessively small disc will "roll into" bands, eliminating the band data almost entirely）。
      隨著滾球半徑加大，各條帶檢測值均由小漸大。弱信號條帶和強背景干擾條帶檢測值飆升，說明對扣除背景的作用弱化。當半徑超過一定范圍，球體弧線由于太“平直”無法與測試曲線相切，徹底喪失去背景的作用。這一點ImageJ和UVP軟件指南的結(jié)論是一致的。這也驗證了《在Western Blot條帶定量分析中圖像灰度值的應用實測-上》采用的“一帶一景”策略的必要性。

四、結(jié)語
      ImageJ指南雖然關于圖像背景扣除中滾球半徑設置方法缺少必要說明。但是半徑設置的整體原則是要要求的，即：視不同分析對象而定，依圖像背景情況而定，半徑值相當于被分析對象在圖像上的最大尺寸范圍。
      而Western Blot圖像條帶分析實測經(jīng)驗，同一Blot中，不同條帶因外形和周圍背景條件有別，宜采用不同優(yōu)化半徑。 而不同批次的Western Blot圖像，因凝膠電泳和印跡雜交操作過程存在差異，即便采用同一個成像系統(tǒng)和完全相同成像曝光設置，背景扣除滾球半徑也是一“徑”難求。
      電泳凝膠和Western Blot圖像條帶定量分析中，扣除背景滾球半徑的設定時，到底參考什么尺寸才符合分析要求？此話題將在《Western Blot條帶分析中如何確定ImageJ滾球半徑？》中討論。

參考文獻
      1. Bio-Rad Quantity One User Guide for Version 4.4
      2. Life Science Software Installation and User Instructions (81-0254-01 Rev L)
      3. ImageJ User Guide (IJ 1.46r)